Быстрая эволюция диких пчел, подвергшихся воздействию клеща Варроа

Быстрая эволюция диких пчел, подвергшихся воздействию клеща Варроа
Тип статьи:
Авторская

Введение

 Появление новых возбудителей болезни может привести к коллапсу популяции пчел, создавая серьезные проблемы выживания. В частности, утрата генетического разнообразия во время селекции может поставить под угрозу долгосрочную жизнеспособность популяций, сделав их менее устойчивыми к будущим стрессам. Опасности, связанные с введенными инфекционными заболеваниями, особенно велики, когда они затрагивают сельскохозяйственно важные виды.

 Медоносная пчела Apis mellifera является ярким примером вида, который чрезвычайно важен для сельского хозяйства и испытывает эпизоды крупномасштабной смертности, вызванной новыми патогенными микроорганизмами и паразитами. Эктопаразитарный клещ Varroa destructor, завезенный из Азии, за последние десятилетия убил миллионы пчелиных семей в Европе и Северной Америке. Помимо питания гемолимфой взрослых и развивающихся пчел, эти клещи выступают в роли инкубаторов и мощных переносчиков вирусов, поражающих медоносных пчел, следовательно, они способствуют распространению вирулентных штаммов вирусов пчел. Учитывая важность внутриколониального генетического разнообразия для устойчивости к болезням и других особенностей колоний медоносных пчел, знание того, как массовые вымирания, вызванные Варроа, повлияли на генетическое разнообразие медоносных пчел, имеет решающее значение для их сохранения.

 В этом исследовании изучались генетические последствия поражения клещем Варроа колонии диких пчел в Северной Америке. Предшествующая работа показала, что популяции диких колоний в Северной Америке пережили катастрофы, совпадающие с появлением V. destructor и последующими периодами выздоровления. Восстановление, по-видимому, основано частично на иммиграции более устойчивых пчел (например, африканских медоносных пчел) и частично на отборе реликтовых пчел.

 Однако трудно получить полную картину генетических эффектов и влияния естественного отбора на медоносных пчел, изучая только современные образцы. Большинство инструментов, разработанных до сих пор для этой цели, лучше всего работают при обнаружении жестких выборочных разверток. Более того, инструменты, которые могут обнаруживать выборочные и демографические изменения, такие как имитация на основе коалесценции или приблизительные байесовские вычисления, трудно применять для медоносных пчел из-за сложности их генетики и истории жизни. В частности, медоносные пчелы имеют гаплодиплоидное определение пола, а матки в колониях медоносных пчел спариваются с многочисленными трутнями. Кроме того, новые колонии образуются роением, процесс, при котором старая матка улетает с подмножеством своих рабочих пчел, чтобы устроить новую семью в новом месте, в то время как одна из ее дочерей остается в улье и продолжает существующую колонию в старом гнезде. Хотя колония, живущая в умеренной зоне, роится не чаще нескольких раз в год, она обычно производит трутней в течение всего лета. Многие неизвестные параметры, связанные с историей жизни медоносной пчелы, затрудняют точное определение генетической структуры.

 В принципе, самым мощным средством обнаружения микроэволюционных изменений является сравнение аллельных частот до и после отбора. Музейные коллекции, открывающие окно в прошлое, предоставляют особые возможности для изучения генетических эффектов. Мы используем образцы, собранные в 1977 и 2010 годах в колониях диких медоносных пчел, обитающих вокруг Итаки, штат Нью-Йорк, чтобы взглянуть на весь спектр генетических изменений, которые произошли у медоносных пчел за этот 33-летний период, что как раз охватывает внедрение Варроа в этом регионе мира. Мы делаем это, используя новый процесс подготовки образцов без ПЦР, разработанный специально для этой цели.

 Мы показываем, что хотя популяция медоносных пчел сильно пострадала от появления паразитарных клещей, она, скорее всего, не вымерла. Скорее пчелы быстро эволюционировали, чтобы смириться с присутствием клещей, и теперь они живут в такой же плотности колоний, как и в прошлом. Этот ответ, скорее всего, был полигенным, но, возможно, включает некоторые из тех же путей, которые ранее были определены при устойчивости к Варроа, а именно дофаминергический контроль аверсивной памяти. Эти результаты показывают, что дикие популяции медоносных пчел обладают неотъемлемой способностью вызывать быстрый эволюционный ответ на новых паразитов.

Полученные результаты.

Устранение отклонений.

 Образцы музея были секвенированы с использованием специального протокола подготовки образцов (рис. 1). Старые и современные образцы различались по степени фрагментации ДНК и посмертным изменениям нуклеотидного состава, что, в свою очередь, приводило к различиям в скоростях картирования и охвате (см. Дополнительную таблицу 1 для профилей повреждения современных и музейных образцов). Короткие выборки из старых образцов могут вызывать искажения картографирования, особенно в тех регионах, где имеются значительные несоответствия с последовательностью эталонного генома, например, вблизи полиморфизмов вставки / делеции или полиморфизмов с несколькими нуклеотидами (MNPs). Поэтому было важно провести строгую фильтрацию и убедиться, что данные соответствуют априорным ожиданиям теории популяционной генетики. Например, разница между старыми и современными частотами аллелей должна быть распределена как случайная величина со средним нулем и должна иметь дисперсию, связанную с числом поколений между двумя выборками и с эффективным размером популяции. Стандартизированные по дисперсии расхождения следуют стандартному нормальному распределению, предполагая, что старые и современные образцы дают сопоставимые и несмещенные оценки частот аллелей (Рис. 2). Точно так же частоты аллелей в нейтральных локусах должны быть коррелированы между двумя популяциями, которыми они являются (дополнительная рис. 1). Мы пришли к выводу, что нейтральная динамика достаточно хорошо отражена в наших данных, что позволяет нам рассмотреть их биологические последствия. Конечная плотность SNP около одного на 1,5 кбайт не позволила нам выделить отдельные генетические варианты, которые могут быть прямыми объектами отбора. Для исторического сравнения плотность SNP была выше, чем у других популяционных геномных проектов, таких как HapMap Phase I21, которые имели плотность SNP примерно один раз в 5 kb.

Figure 1: PCR-free library preparation.

Рис. 1

(а) фрагменты ДНК денатурированы, и (б) контролируемое количество рибогуанидинов добавлено к 3'-концу 64. (в) Затем этот хвост использовали для лигирования полноразмерного праймера для секвенирования Illumina, (d), который затем может быть используется для синтеза второй цепи. (e) Затем другой адаптер для секвенирования можно привязать к двухцепочечному продукту. Этот протокол допускает прямое секвенирование входных шаблонов в масштабе нанограмм, без смещения и загрязнения, вызванных ПЦР

Полноразмерное изображение

Рисунок 2: Аллельные частотные отношения между старым и современным составом популяции для 150 647 SNP.

Рис. 2

 Все частоты были подвергнуты угловому преобразованию для стабилизации дисперсии, следуя Фишеру и Форду65. Маркеры, выделенные красным, показывают существенные различия между старой и современной популяциями в соответствии как с тестом, основанным на частотах аллелей, так и тестом, основанным на частотах гаплотипа. При делении на среднее значение нейтральные изменения частот аллелей должны соответствовать стандартному нормальному распределению (синяя линия). 95-процентный доверительный интервал для возможных сдвигов частоты аллелей в результате совместного действия дрейфа и иммиграции показан серым цветом. Мы использовали межквартильный диапазон (IQR / 1.349) в качестве надежной оценки s.d. Частоты аллелей должны коррелироваться в популяции, отобранной в разное время, разбросанной по линии y = x (синий). Точки были сделаны прозрачными, чтобы минимизировать избыточный график. Осталось от предыдущей версии рисунка. Тем не менее, большинство локусов соответствуют популяционным генетическим ожиданиям для нейтрально колеблющихся вариантов.

Полноразмерное изображение

Оценка величины миграции и дрейфа

 Отбор, дрейф и миграция — все это вызывает микроэволюционные изменения, которые рассматриваются как отклонения от нулевых разностей частот аллелей на рис. 2. Чтобы обсудить возможные селективные эффекты, мы сначала оценили величину неадаптивных эволюционных сил. Вклад иммиграции и дрейфа в современные данные также можно оценить, изучив маркеры, отсутствующие в старом населении, но присутствующие в современном населении (12,5% от всех маркеров). Маркеры, отсутствующие у музейной популяции пчел (или присутствующие с низкой частотой), могут увеличиваться по частоте, главным образом, за счет дрейфа и миграции. В результате наблюдаемые изменения в этих маркерах должны обеспечить эмпирическое средство для оценки совместного действия этих двух эволюционных сил в течение 33-летнего периода. Изменение «новых» маркеров приведет к переоценке действия дрейфа и миграции, поскольку (1) некоторые маркеры могут отсутствовать в музейных экземплярах из-за плохого отображения при чтении, и (2) некоторые введенные маркеры могут находиться под положительным отбором. Оба этих фактора, а также изменчивость стохастической выборки, увеличат количество различий в частотах старых и современных аллелей и приведут к завышенным оценкам изменений из-за дрейфа и иммиграции. Несмотря на консервативную оценку величины дрейфа и иммиграции, все аллели, показывающие существенные различия между старой и современной популяциями, находятся за пределами 95% интервала, где иммиграция и дрейф играют существенную роль, предлагая вместо этого действие естественного отбора (рис. 2).

Митохондриальная демография

 Демографическая история важна для понимания характера и силы изменений. К сожалению, никаких исследований диких колоний медоносных пчел в районе исследований не проводилось в 1990-х годах, то есть во время прибытия клеща Варроа. Чтобы обнаружить изменение размера популяции за это время, мы исследовали изменения в разнообразии митохондриальных геномов. Присутствующие во многих копиях, эти геномы могут быть секвенированы с чрезвычайно высоким охватом в каждом образце, что дает многовариантные генотипы без пропущенных данных, что позволяет обойти посмертные изменения в содержании ДНК посредством избыточного охвата последовательности, а набор митохондриальных данных был секвенирован с чрезвычайно высокой точностью. Высокая глубина (10 481 ± 4430x и 20,422 ± 7,115x для старых и современных групп пчел соответственно). Он состоял из 401 SNP и не имел пропущенных данных. Потеря митохондриального разнообразия с 1977 года поразительна — почти все старые митохондриальные линии исчезли, что указывает на значительное сокращение эффективного размера популяции (Рис. 3). Очевидно, что хотя численность колонии восстановилась, большинство выживших пчел являются потомками небольшого числа матерей, некоторые из которых, возможно, были мигрантами, сбежавшими из ульев пчеловодов, когда колонии роились.

Рисунок 3: Филогения митохондриальных геномов и изменения в эффективном размере популяции.

Рис. 3

Подавляющее большинство митохондриального генетического разнообразия в старой популяции (синий цвет) утрачено в современной популяции (красный цвет). Коалесцентный анализ оценил 95% наивысшую апостериорную плотность митохондриального Ne между 2 × 105 и 2 × 106 пятьдесят лет назад по сравнению с 300–1800 в настоящее время. Эти данные предполагают, что появление клеща Варроа было связано с массовой гибелью колоний и интенсивным отбором, действующим на пчел. Основная митохондриальная база, по-видимому, полностью исчезла. Наиболее распространенный гаплотип, присутствующий у многих современных пчел и у одной из старых пчел, идентичен митохондриальному гаплотипу A. mellifera ligustica (итальянский гапплотип). Современная популяция, по-видимому, произошла от сравнительно небольшого числа маток. Узлы со сплошными кружками соответствуют 1,0 апостериорной вероятности, тогда как узлы с незакрашенными кружками представляют вероятности> 0,95.

Полноразмерное изображение

Ядерная демография

Ядерные геномы секвенировали при промежуточном охвате как для старых, так и для современных популяций (8,0 ± 3,5х и 16,1 ± 3,5х соответственно). После фильтрации этот набор данных содержал 181 352 высококачественных образцов SNP (примерно один на 1,5 кб). В отличие от результатов митохондриального генома, общая потеря ядерного генетического разнообразия не была обнаружена (Fig. 4a). Гетерозиготности не различались между двумя популяциями (критерий Уилкоксона, Р = 0,070; n = 168 185 парных сайтов). Аналогично, коэффициенты инбридинга оставались постоянными (n = 64, F = 0,04 ± 0,03; Welch t51 = -1,1, P = 0,25). Более низкая потеря ядерного, по сравнению с митохондриальным, генетическим разнообразием может быть результатом сочетания экстремальной полиандрии и высокого размножения медоносных пчел24. Взятые вместе, митохондриальные и ядерные данные показывают, что популяция диких колоний испытывала чрезвычайно высокую смертность, но это происходило без заметной потери ядерного генетического разнообразия.

Рисунок 4: Визуализация ядерно-генетических изменений с течением времени с использованием анализа основных компонентов.

Рис. 4

(а) Анализ основных компонентов и (б) изменения в наследственных популяциях. В отличие от митохондриальных данных, ядерные данные не показывают существенного сокращения разнообразия, а только сдвиг среднего значения между двумя популяциями. Хотя пропорции различных наследственных популяций изменились, число наследственных популяций осталось прежним. Fst между старым и современным населением составляет 0,022 ± 0,056. Это говорит о том, что, несмотря на уровень смертности на уровне колоний, вызванный Варроа, большая часть ядерного генетического разнообразия сохранилась, возможно, благодаря производству трутней как сильными колониями, так и колониями, слишком слабыми, чтобы роиться (производить маток), но все еще достаточно сильными, чтобы производить трутней. Анализ примесей показывает, что старые и современные популяции в значительной степени являются потомками среднеевропейских пчел (карниоланский и итальянский подвид, популярный у пчеловодов), хотя у них также есть гены из Западной Европы и Центральной Азии. Кроме того, современные пчелы имеют детектируемый компонент африканского происхождения. Интересно, что современные пчелы демонстрируют рост генетического происхождения с Аравийского полуострова, который обычно не встречается в домашних условиях. Эти данные предполагают смесь иммиграции и генетической преемственности в современной популяции диких колоний.

Полноразмерное изображение

 Биогеографические данные недавно опубликованных исследований (25, 26) могут быть использованы для изучения изменений в составе популяции предков с течением времени (Рис. 4b; Дополнительно Рис. 2). Современные популяции колоний диких медоносных пчел демонстрируют небольшой уровень интрогрессии африканских генотипов, что согласуется с появлением африканских пчел в США в начале 1990-х годов. Диапазон тропически адаптированных африканизированных пчел ограничен югом Соединенных Штатов, где также происходит большая часть коммерческого производства пчелиных маток. Присутствие небольшого количества африканских генов в штате Нью-Йорк, скорее всего, обусловлено отправкой пчел-маток из южных штатов в северные штаты.

Изменения в эффективной численности семей

 Временные изменения в частотах ядерных аллелей также могут быть использованы для оценки эффективного размера популяции (Ne). Дисперсия различий между частотами аллелей в старых и современных популяциях должна быть равна числу поколений, деленному на 2 × Ne20. При условии одного или двух поколений в год, это дает эффективный размер популяции между 327 и 653 колониями соответственно. Эти значения могут быть незначительными недооценками, так как дополнительная изменчивость будет вноситься ошибками в генотипировании20, но они согласуются с независимыми оценками Ne для коалесценции для современной популяции по данным митохондрий (рис. 3). Поскольку Ne, как правило, примерно в 10 раз меньше, чем численность населения переписи27, эти результаты показывают, что популяция диких колоний составляет порядка нескольких тысяч колоний.

Популяция диких медоносных пчел не вымерла

 Важно учитывать возможность того, что первоначальная популяция колоний вымерла, после появления Варроа в районе исследования, и что нынешняя популяция существует из-за миграции колоний из ульев пчеловодов в соседнем регионе. Недавнее микроисследование диких и домашних колоний медоносных пчел, живущих вблизи Итаки, штат Нью-Йорк, выявило сильные генетические различия между ними, что позволяет предположить, что дикая популяция является не просто поглотителем сбежавших домашних колоний (28). Тем не менее, имеются данные о притоке генов из коммерческих популяций, такие как увеличение митохондриальных генотипов, обычно используемых в пчеловодстве (Рис. 3), и интрогрессия африканских генов (Рис. 4b).
 В соответствии со сценарием можно сделать два прогноза, что дикие пчелы Итаки не вымерли, но сохранились при некотором уровне миграции в них других пород. Во-первых, поскольку коэффициенты родства уменьшаются экспоненциально с уменьшением степени родства, у музейных пчел должно быть больше регионов, идентичных по происхождению, общих с современной популяцией Итаки, чем с другими домашними пчелами США, с которыми они будут иметь более отдаленное происхождение. Во-вторых, недавний поток генов между современными пчелами Итаки и домашними пчелами США должен создать больше регионов, идентичных по происхождению между современными популяциями пчел, чем между музейными пчелами и домашними пчелами США. Оба эти прогноза верны, предполагая, что популяция существовала постоянно (рис. 5).

Рисунок 5: Родство музейных и современных образцов, собранных в диких колониях, относительно современного образца, собранного в домашних колониях.

Рис. 5

Музейные (синие) и современные (красные) образцы показывают асимметричную родственность по сравнению с внешней выборкой домашних пчел США (черная). Музейные пчелы более тесно связаны с пчелами из той же популяции, чем с другими домашними пчелами США (N = 32, P = 6,0 × 10–6). Аналогичным образом, домашние пчелы США более тесно связаны с современными дикими пчелами, чем с музейными пчелами (N = 10, P = 2,2 × 10–3), что предполагает постоянный поток генов в популяцию диких пчел. Связи между музеем и современными пчелами выделены серым цветом, а связи между домашними пчелами США и пчелами Итаки — оранжевым, причем четыре оттенка каждого цвета соответствуют четырем квартилям родства, превышающим ноль в наборе данных.

Полноразмерное изображение

Признаки селекции

 Геномные данные дают некоторые подсказки о механизмах, с помощью которых современные пчелы переносят заражение клещем Варроа. Сигнатуры отбора широко распространены по всему геному: 634 элемента показывают значительные изменения частоты в двух временных точках (дополнительная рис. 3). Эти элементы пересекались с 232 моделями генов, разбросанных по всему геному (дополнительная фиг. 3). Около половины терминов обогащенной генной онтологии (GO) связаны с развитием, что позволяет предположить, что резистентность может быть результатом изменений в программе развития пчелы (дополнительная таблица 2). Это кажется правдоподобным, учитывая, что большая часть размножения клещами должна быть завершена на стадии коротких куколок рабочих медоносных пчел(29). Изменения в движении личинок и паттернах линьки также могут убивать развивающихся клещей (30). В соответствии с изменениями в генах развития, были также изменения в размере тела и форме крыла.

Изменения в размерах и форме тела

 Найдя доказательства отбора генов развития, мы предсказали, что со временем обнаружим морфологические изменения. Действительно, произошло общее уменьшение размеров тела (ширина головы: n = 64, t43,3 = −8,0, P = 4,0 × 10–10; межпозвоночный промежуток: n = 64, t62,8 = −8,6, P = 3,35 × 10−12; дополнительная рис. 5). Аналогичным образом, канонический вариационный анализ ориентиров пчелиного крыла обнаружил существенную разницу в средней форме крыла между старым и современным популяциями (n = 64, t53.4 = 11, P = 2.4 × 10-15; доп. рис. 5). Эти морфологические изменения согласуются с изменениями в основной программе развития, хотя они также могут быть результатом стресса, вызванного заражением клещами или другими воздействиями на окружающую среду. Африканские пчелы, которые проявляют устойчивость к Варроа, меньше, чем европейские пчелы. Таким образом, найденные здесь изменения в размере, если они адаптивные, являются результатом конвергентной адаптации или, возможно, потока генов от пчел африканского происхождения.

Сравнение с количественными исследованиями локусов

 В нескольких недавних исследованиях были идентифицированы локусы количественных признаков (QTL) у пчел для дикой популяции, у которой развилось сопротивление (31), или у пчел, у которых были обнаружены поведенческие черты, которые подавляют Varroa (32,33), что делает интересным изучение вопроса о том, действует ли отбор сходно на механизмы устойчивости. Следует отметить, что поскольку многие гены могут быть связаны с конкретным QTL, а не только с выбранным геном, сравнения имеют высокий потенциал для ложноположительных результатов, поэтому к этим результатам следует относиться с некоторой осторожностью. Тем не менее, существуют интересные параллели между предыдущими исследованиями QTL и эволюционными результатами пчел Итаки. Наиболее поразительно, что в двух исследованиях QTL, одно из которых было посвящено диким медоносным пчелам, а другое — поведению, чувствительному к варроа-гигиене, идентифицировал тот же ген дофаминового рецептора (AmDOP3), который, по-видимому, также отбирался у пчел Итаки (дополнительная таблица 3)., Показано, что этот ген играет роль в формировании неприятной памяти у пчел34. Два других гена, участвующих в развитии тела гриба и образовании синапсов, расположенных в областях QTL на отдельных хромосомах, также демонстрируют признаки селекции в Итаке (дополнительная таблица 3). Эти гены и общее обогащение генов, участвующих в дифференцировке глиальных клеток (дополнительная таблица 2), позволяют предположить, что поведение играет важную роль в борьбе с заражением варроа. В целом, исследования QTL подтверждают полигенную природу адаптации к Варроа, о чем свидетельствуют широкомасштабные генетические изменения, наблюдаемые в популяции итаки медоносных пчел.

Обсуждение

 Утрата генетического разнообразия может сделать популяции животных и растений уязвимыми после масштабных коллапсов, вызванных новыми заболеваниями. Генетические изменения, с которыми сталкиваются медоносные пчелы, живущие в дикой природе за пределами Итаки, штат Нью-Йорк, после появления Варроа, привело к серьезному узкому месту в митохондриях и повлекло за собой небольшую потерю ядерного генетического разнообразия. Это говорит о том, что популяции медоносных пчел, живущих в дикой природе, могут пережить воздействие новых патогенов. Уровень генетического разнообразия, который присутствует в диких колониях медоносных пчел, может быть хорошей целью для управляемых колоний, чтобы обеспечить их будущую адаптивность.

Учитывая количество времени, которое прошло между точками отбора проб в этом исследовании, генетические изменения не могут быть приписаны конкретно к отбору Варроа, так как в 33-летнем периоде, вероятно, действует много селективных сил. Представляется вероятным, что Варроа вызвал серьезные генетические изменения в популяции на основании данных митохондрий (рис. 3) и сравнений с другими популяциями, которые были изучены сразу после появления клещей (11,35). Тем не менее, некоторая мера достоверности исходит из обнаружения признаков отбора по гену AmDOP3, который, по-видимому, участвует в гигиеническом поведении (32), в этом исследовании, в другой устойчивой к варроа популяции пчел (31), и в исследовании QTL поведенческой устойчивости к варроа (32). Этот ген, по-видимому, является особенно привлекательной мишенью для искусственного отбора на основе маркеров, направленых на повышение устойчивости пчел к клещам.

 Популяция из музея более тесно связана с современными пчелами, живущими в том же районе, по сравнению с другими домашними пчелами США (доп. рис. 4; рис. 5). Тем не менее, мы не можем строго исключить исчезновение популяции Итаки с последующей повторной колонизацией из более тесно связанных популяций, включая домашние, поскольку необходимо было бы отобрать пчел с 1990-х годов, когда произошло бы гипотетическое вымирание. Эти образцы вряд ли существуют. Тем не менее, мы считаем, что полное вымирание маловероятно по двум дополнительным причинам. Во-первых, все другие популяции диких пчел, которые находились под наблюдением во время появления Варроа, прошли через серьезные узкие места, но ни одна из них на самом деле не вымерла (10,11,35,36). Во-вторых, современная популяция диких пчел Итака поддерживает митохондриальные генотипы, не связанные с коммерческими гонками пчел (рис. 3), которые могут быть потеряны при исчезновении. Хотя эти линии доказательств являются косвенными, они все указывают на постоянное постоянство населения в состоянии иммиграционного отбора.

Представленные здесь результаты подтверждают мнение о том, что ответы на внезапные изменения в селективных режимах могут быть в высокой степени полигенными и могут быть результатом изменений в частотах аллелей либо постоянной вариации, либо аллелей, полученных в результате иммиграции. Эти сигналы нелегко обнаружить только по современным данным. Хотя исследования, основанные на старых образцах ДНК, таких как образцы из музейных образцов, являются сложными и редко возможными, они дают ценный взгляд в прошлое, показывая, как на самом деле действовал отбор в природных популяциях. Такие исследования необходимы для разработки более сложных моделей естественного отбора, которые учитывают широкий спектр геномных реакций наряду с другими характеристиками естественных популяций, такими как демографические изменения и иммиграция.

Методы исследования

Образцы

 Мы использовали рабочих медоносных пчел, собранных в диких колониях, живущих в лесах округа Томпкинс около Итаки, штат Нью-Йорк, США (1233 км2). Рабочие из 32 колоний были собраны в 1977 году и хранились в виде прикрепленных образцов в коллекции насекомых Корнелльского университета (37). Мы также использовали равное количество работников, собранных в 2010 году из 32 диких колоний, живущих в том же округе. Учитывая, что дроны и королевы могут пролетать несколько километров, можно с достаточной уверенностью утверждать, что дикие пчелы округа Томпкинс составляют одну популяцию (38). Один работник на колонию использовался при генетическом анализе.

Молекулярные методы

 Общий протокол был аналогичен протоколу Tin et al. 39, но с несколькими модификациями, позволившими использовать корректирующую полимеразу и более высокий выход, что позволило провести ПЦР-секвенирование (рис. 1). Мы опишем это подробно ниже, и самую последнюю версию этого протокола можно найти на нашем веб-сайте лаборатории (http://ecoevo.unit.oist.jp/site/methods/).

Экстракция геномной ДНК

 ДНК из музейных образцов была извлечена, как описано Tin et al.39. Рабочий стол очищали отбеливателем перед экстракцией, затем протирали дистиллированной водой. Пинцет очищали этанолом и обжигали перед обработкой образцов. Использовались только гарантированные одноразовые расходные материалы без ДНК, а реагенты предназначались только для старых исследований ДНК. Расходные материалы и реагенты были использованы отдельно от тех, которые использовались в других экспериментах в лаборатории. Наконечники фильтра были использованы для всех экспериментальных процедур. Буфер для экстракции ДНК содержал 50 г изотиоцианата гуанидина, 5,3 мл 1 М трис-HCl (рН 7,5), 5,3 мл 0,2 М ЭДТА, 10,6 мл 20% саркозила (IBI Scientific) и 1 мл β-меркаптоэтанола, растворенного в 50 мл. вода (ссылка 39). Цельные образцы помещали в 2 мл микроцентрифужные пробирки с 800 мкл буфера для экстракции ДНК для инкубации в течение ночи при 55 ° C. К лизату ДНК добавляли равный объем 99,5% этанола и 20 мкл магнитных шариков кремнезема (Chemicell GmbH). Пробирки осторожно перемешивали и инкубировали на роторном смесителе при комнатной температуре в течение 15 минут. Все химические вещества были приобретены у Nacalai Tesque, Inc., если не указано иное. Затем пробирки помещали на магнитную подставку (Invitrogen) на 5 минут для отделения супернатанта от магнитных шариков. Супернатант, содержащий белки и другие примеси, отбрасывали. Бусы со связанной ДНК промывали 200 мкл РЕ-буфера (Qiagen) в течение 10 минут при комнатной температуре на роторном смесителе с последующим разделением бусин на магнитной подставке. Стадию промывки повторяли еще два раза, и затем шарики сушили на воздухе в течение 30–45 мин до полного высыхания. Затем пробирки удаляли с магнитной подставки и элюировали ДНК с шариков, ресуспендируя их в 50 мкл ЭБ (Qiagen). После 10 мин инкубации при 55 ° С ДНК отделяли от шариков на магнитном стенде и переносили в новые микроцентрифужные пробирки. Для современных пчел мы извлекали геномную ДНК, используя наборы DNeasy для крови и тканей (Qiagen). Количество ДНК оценивали с помощью набора для анализа dsDNA Quant-iT P

78
RSS
Фахреддин
13:44 (отредактировано)
+1

Здравствуйте! 

Во первых понятие диких медоносных пчел — относительное, это попросту слетевший рой «домашних пчел» с промышленной пасеки. 

2. На этих диких пчел сильное (я бы сказал решающее) влияние оказывают ближлежащие в округе промышленные пасеки и их селекция. Трутни-старатели из близлежащих хозяйств, влияют на точность митохондрианального ДНК анализа диких пчел, поэтому утверждать что за 30 с лишним лет дикие пчелы сэволюционировали не совсем корректно. (Помоему! )

3. Как не печально клещ Варроа также не сидит сложа руки — закаляется, эволюционирует (звереет, ускоряется репродуктивные процессы в генах клещей)

4. Дикие пчелы не размножаются (развиваются) столь сильно как промышленные. Агрессивные условия проживания в дикой природе диктует им быть малочисленными, компактными и мобильными. Плодовитость у них ограничена, во время медоносного сезона расплодная часть заливается медом, расплод несколько раз прерывается из-за того что некому отбирать излишки. Следовательно расплода для размножения клещей очень мало.

Исскуственная селекция на данный момент добилась больших успехов в развитии (чрезмерного разрастания колонии промпчел для сбора мёда).

5. Массовый слёт (синдром, коллапс) — это спасительный механизм колонии. Ослабевшая колония из-за варроатоза впадает в «исскуственный рой», в некоторый момент решает покинуть улей с погибшим и тухнущим расплодом.  Этот малочисленный рой прививается где нибудь, сильно вибрируют и разогреваются (до +40°С и более), чтобы избавиться от остатков клещей на теле. 

Но для практического пчеловодства роение и слёт пчел, явления нежелательные. И исскуственная селекция направлена на искоренение данных генов, что противоречит законам естественного отбора диких сородичей.

Думаю надо скорректировать исследования и продолжать в закрытой популяции и на острове!

Спасибо! 

13:54 (отредактировано)
+1

Здравствуйте! Насколько я понял, в статье речь про музейную коллекцию пчел, взятых из живой природы в начале 1980х и проведено сравнение с этой же колонией через некоторое количество лет. 

Есть погрешность на перекрестное оплодотворение от пасек, но основная мысль про генетические изменения по иммунному ответу на клеща.

Загрузка...